热门搜索: 96T/48T小鼠骨成型蛋白7(BMP-7)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠儿茶酚胺(CA)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠第八因子相关抗原(FⅧAg)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠抵抗素(Resistin)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠蛋白激酶B(PKB)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠催乳素(PRL)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠雌激素(E)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠吡啶交联物(PY)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠白血病抑制因子受体(LIFR)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠白三烯B4(LTB4)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠白介素1(IL-1)ELISA试剂盒 96T/48T小鼠β内啡肽(β-EP)ELISA试剂盒

技术文章/ Technical Articles

您的位置:首页  /  技术文章  /  丙酮酸脱羧酶(PDC ) 活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法

丙酮酸脱羧酶(PDC ) 活性测定试剂盒说明书 紫外分光光度法

更新时间:2024-02-18      浏览次数:173

                                                                规格:50管/48样

丙酮酸脱羧酶( pyruvate decarboxylase,PDC )活性测定试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理:

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化 NADH还原乙醛生

成乙醇和NAD+;NADH在340nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂四:粉剂×1 瓶,﹣20℃保存。

试剂五:液体×1 瓶,﹣20℃保存。

混合试剂:临用前配制,小心把试剂四和五转移到试剂三中,充分溶解。

试剂六:液体×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一,超声波破碎细菌或细胞(功率200W,工作3s,间歇10s,工作35次),16000g 4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2、组织处理:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组

织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,16000g 4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)等液体样品:直接检测。

PDC 测定操作:

1. 分光光度计预热30min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃水浴中预热30min。

3. 空白管:依次在 1mL 石英比色皿中加入100μL蒸馏水、100μL混合试剂、700μL试剂二

和100μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为 A1 和A2。

4. 测定管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合试剂、700μL试剂二

和100μL试剂六,迅速混匀后于340nm 比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A3和A4。

注意:空白管只需测定一次。

PDC 活性计算公式:

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷(Cpr×V 样) ÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:25℃中,每克组织每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。

PDC (μmol/min/g) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃中,每104个细胞每分钟催化1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。

PDC (μmol/min/104 cell) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷细胞数量

(4)按血清(浆)体积计算

活性单位定义:25℃中,每毫升血清(浆)每分钟催化1μmolNADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min /mL) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×106 }÷V 样÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]

 

ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 总:反应体系总体

积,1mL=0.001L,V 样:加入反应体系中上清液体积,0.1mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W:样本质量,g ;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1 min。

 

注意事项:

配制好的混合液 3 天内使用完。


微信扫一扫

邮箱:2924516602@qq.com

传真:02166566405、19121610072

地址:上海市奉贤区金海公路6055号11幢5层

Copyright © 2024 上海佰利莱生物科技有限公司版权所有   备案号:沪ICP备2022021373号-4   技术支持:智慧城市网