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木质素过氧化物酶(Linin peroxidase ,Lip)试剂盒

更新时间:2023-05-08      浏览次数:340

木质素过氧化物酶(Linin peroxidase Lip)试剂盒说明书

微量法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)是一种含亚铁血红素的过氧化物酶,属于木质素降解酶系,在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。

测定原理

木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛,在 310nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)。

试剂组成和配制

试剂一:液体 115mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 4mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂三:液体 2mL×1 支,4℃保存。

酶液提取

1. 组织:按照质量(g):试剂一体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL试剂一)加入试剂一,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心10min,取上清置于冰上待测。

2. 细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后 4℃,10000g 离心10min,取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体:直接检测。

测定操作


测定管

试剂一(μL

120

试剂二(μL

40

样品(μL

20

试剂三(μL

20

充分混匀,于微量石英比色皿/96 孔板,蒸馏水调零,测定 310nm 10s310s 吸光值,记为 A1 A2,△A=A2- A1

酶活计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性(nmol/min/mg prot=△A÷ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 215×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克样品每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性(nmol/min/g=△A÷ε×d)×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 215×△A÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性(nmol/min/104cell=△A÷ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总)÷T

= 215×△A÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每升培养液每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性(nmol/min/L=△A÷ε×d)×V 反总÷V 样÷T= 2.15×105×△A

ε:藜芦醛摩尔消光系数:9300L/mol/cmd:比色皿光径,1cmV 反总:反应总体积,1mL

V 样:反应中样本体积,0.1mLV 样总:加入提取液体积,1mLCpr:样本蛋白浓度,mg/mLW:样本质量,gT:反应时间,5min

b. 96 孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

LiP 活性(U/mg prot=△A÷ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T= 430×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克样品每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

LiP 活性(U/g=△A÷ε×d)×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T= 430×△A÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

LiP 活性(U/104cell=△A÷ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总)÷T

= 430×△A÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每升培养液每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

LiP 活性(U/L=△A÷ε×d)×V 反总÷V 样÷T= 4.3×105×△A

ε:藜芦醛摩尔消光系数:9300L/mol/cmd:比色皿光径,0.5cmV 反总:反应总体积,

1mLV 样:反应中样本体积,0.1mLV 样总:加入提取液体积,1mLCpr:样本蛋白浓

度,mg/mLW:样本质量,gT:反应时间,5min


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