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细菌 环二鸟苷酸(c-di-GMP)ELISA试剂盒处理及保存方法

更新时间:2023-04-04      浏览次数:531

                                         细菌Bacteria环二鸟苷酸(c-di-GMP)ELISA检测试剂盒
检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验ELISA)。往预先包被环二鸟苷酸(c-di-GMP)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并全部洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的环二鸟苷酸(c-di-GMP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟
取上清。
5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品

  1. 酶标仪(450nm)

  2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

  3. 37℃恒温箱

操作注意事项

  1.   试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶全部溶解后再使用。

  2.   实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。

  3.   浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。

  4.   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

  5.   所有液体组分使用前充分摇匀。注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、100、200、400、800、1600 ng/mL
    试剂的准备
     20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
    洗板方法

  6.   手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。

  7.   自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

  8. 操作步骤

  9.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

  10.   设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

  11.   样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

  12.   除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

  13.   弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

  14.   每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

  15.   每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

  16. 结果判断
     绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。

  17. 试剂盒性能

  18.  准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。

  19.  灵敏度:最少检测浓度小于1.0 ng/mL。

  20.  特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

  21.  重复性:板内、板间变异系数均小于15%。

  22.  贮藏:2-8℃,避光防潮保存。

  23.  有效期:6个月

  24. 免责声明
      试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或细菌体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。

  25.   严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。


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