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elisa标准品的制备鉴定与计量方法

更新时间:2023-07-25      浏览次数:456

 一、标准品的制备


  标准品的制备是非常复杂的问题,也是标记免疫分析中比较难于制备的一个成分。以下讨论的是实验室标准品(或商品化试剂中标准品)的制备。


  (1)基质的制备:如前所述,作为标准品的介质(基质)成分应与被测样品相同。对大多数用于测定血清中某物质的标准品,应用不含被测物质的零血清制备,以求反应的介质环境相当。但有时零值血清的制备十分困难,所以有些标准品用适当的缓冲液制备,并在缓冲液中加入一定量的载体蛋白(一般用1%~2%的牛血清白蛋白),以便使其与样品的介质环境相近。


  零值血清的制备方法有:


  A、吸附法:血清中小分子物质如三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素(T4)等,可用活性炭吸附去除。这种方法简便,但待测物质难以清除干净,而且大分子活性物质不能用此法进行制备。


  B、反复冻融法:对大分子活性物质可选用低值血清,经反复冻融使被测物质失活。用这种方法可使某些蛋白类激素大部分失活,但也难以得到真正的零值血清。


  C、亲和层析法:用特异性抗体制备亲和层析柱,用以吸附被测抗原。用这种方法可以得到高质量的零值血清,但本法比较复杂而且成本也高。


  (2)标准物纯品的选择:应选择高化学纯和高免疫纯的纯品作标准品。其中免疫纯尤为重要,在标准品中不应含有与被测物质有交叉反应的物质。


  (3)标准品的制备:先用零值血清配置高浓度的标准品,然后根据实验系统的要求,用零值血清将高值血清稀释至应有的浓度,制成符合预定要求的,由不同浓度组成的系列标准品。

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  二、标准品的鉴定


  (1)免疫活性的鉴定:选用高特异性的抗血清分别作公ren标准品(如WHO的国际参考品或国家标准品)的待鉴定标准品的剂量反应曲线,并观察两条曲线的平行性。如两条剂量反应曲线平行,说明两种物质对同一抗体有相同的亲和力,即二者是同质性物质。如两条剂量反应曲线不平行,说明两种物质具有异质性,因而这一待鉴定的标准品是不能使用的。


  (2)浓度的标定:用已鉴定过的,免疫活性合格的标准品,与公ren的标准品作浓度相同的剂量反应曲线。此时,两条剂量反应曲线应该是基本重合的。如果两者平行但不重合,则取两条剂量反应曲线的50%结合处的相应剂量( ED50 )计算二者的换算系数,然后调整待鉴定标准品的浓度,直至使两条剂量反应曲线wan全或基本重合为止。


  三、标准品的计量



  许多小分子抗原或半抗原已能得到纯品或进行合成,它们对作为标准品的要求可以得到基本的满足,其计量多直接用单位体积中的重量表示,如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推荐用质量单位取代重量单位,即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。对大分子的活性物质则比较复杂。由于得不到绝对的纯品,故很难直接用单位体积中的重量或单位体积中的质量计量。因此,常用该物质的生物活性单位表示,如IU / L、mIU / L等。


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